高等学校「生物�U」の中で、塩基配列解読実験を実施するためのプロトコル集

• これまで、本校の総合的な学習の時間（サイエンスクエスト）で取り組んできた内容は、高等学校「生物�U」に包括される内容だと思っています。そこで、実際に授業の中で、この実験が展開できないかを現在検討しています。実際に実施できれば、かなり系統立った探求活動になると思います。２時間続きの授業が取れれば、実験が実施できるのではと考えています（予算は厳しいものがあるが）。現在考えている実験の展開を以下にまとめてみます。

回	授業 時数	実験テーマ プロトコルはテーマをクリックしてください		実験概要		2005年度 実験風景	2006年度 実験風景
１	１	葉の洗浄		自分がサンプルにする植物の葉を、HEPES洗浄液で洗う。		10月６日	10月３日
２	２	DNA抽出 （CTAB法）	キットによるDNA抽出およびPCR増幅	洗浄した葉からDNAを抽出し、2-プロパノールで沈殿させ、冷凍庫で沈殿を熟成させる。	キットを用いて洗浄した葉からDNAを抽出しPCR反応させるための調整を行い、サーマルサイクラーにセットする。
３	１	PCR増幅		沈殿したDNAをエタノールで洗い、TEに溶解する。次にPCR反応のため、プライマーやTaq等を入れてPCR反応をさせるための調整を行い、サーマルサイクラーにセットする。
４	１．５	電気泳動によるPCR増幅バンドの確認		PCR反応が成功しているかをチェックするため、電気泳動を行う。		10月13日	10月10日
５	１	PCR増幅産物の精製と塩基配列決定用の試料作成		PCR反応生成物をセファデックスで精製する。次にBigdyeを用いてサイクルシーケンス反応をするための調整を行い、サーマルサイクラーにセットする。		10月27日	10月24日
６	２	オートサイクルシーケンス後の試料の精製		サイクルシーケンス反応後の精製を行う。できあがったサンプルは大学に運びシーケンサーにかけてもらう。		11月10日	10月31日
７	２	ベースコール、アセンブル、塩基配列の編集		シーケンサーで読み取った生データは、光シグナルの波形データである。これを、塩基配列に編集していく。		未実施	11月21日
８	２	相同性検索		シーケンサーで読み取った塩基配列をもとに、植物の相同性検索を行う。		１月12日	11月28日
９	２	分子系統樹の作成		クラス（講座）全員の塩基配列データを集めて系統解析し、分子系統樹を作成する(ただしこれは事前に教師が行っておく。手順を説明する程度）。得られた分子系統樹に、植物の形態データを書き込んでいく。		１月19日	１月23日

• 試薬、器具等については以下をクリックしてください。
  • 器具一覧
  • 試薬一覧
  • 各種キット
  • 試薬調整法
  • PCR反応・サイクルシーケンス反応の準備

• 参考図書
  • 島本　功、佐々木卓治監修(1997)　『新版　植物のPCR実験プロトコール』　（秀潤社）　
  • 中山広樹、西方敬人1995）　『バイオ実験イラストレイテッド』�@〜�B　（秀潤社）
  • 大山　徹、渡部俊弘（2002）　『初歩からのバイオ実験』　（三共出版）
  • 田村隆明（2004）　『バイオ試薬調整　ポケットマニュアル』　（羊土社）